Seminario - Instituto de Patología Experimental

Lic. en Ciencias Biológicas: María Estefanía Bracamonte

Becaria doctoral - Temas Estratégicos -  CONICET

Instituto de Patología Experimental

Director: Dr. Jorge D. Marco

Co- directora: Dra. Paola A. Barroso

“Inmunodiagnóstico de leishmaniasis: Expresión, solubilización y purificación del antígeno recombinante Lb-Ag6 de Leishmania braziliensis”

Introducción. Las leishmaniasis son zoonosis causadas por parásitos flagelados del género Leishmania. Son consideradas como desatendidas y emergentes por la Organización Mundial de la Salud, siendo predominantes en Salta las formas clínicas cutánea y mucocutánea causadas por L. (Viannia) braziliensis, para las que se requieren el desarrollo de nuevos métodos diagnósticos.  LbAg6, una proteína mitocondrial de L. (V.) braziliensis de aproximadamente 50 Kda, se seleccionó como uno de los candidatos para el imunodiagnóstico de estas enfermedades.

 Objetivo. Expresar y purificar la proteína de fusión Hystag-LbAg6 obteniéndose en las cantidades y condiciones requeridas de pureza para su aplicación en inmunodiagnóstico.

Métodos. Se cultivaron células competentes de la cepa BL21-DE3 de Escherichia coli transformadas con el plásmido PIVEX-LbAg6, posteriormente se indujeron a distintas concentraciones de IPTG y se incubaron a diferentes tiempos y temperaturas. La proteína se solubilizó mediante distintos protocolos de agentes caotrópicos de disolución. La purificación se llevo a cabo utilizando la resina de Níquel Ni-NTA (QIAGEN).

 Resultados. Se fijaron las condiciones óptimas de: concentración de IPTG 1mM, temperatura 37ºC y tiempo de incubación 4 hs, e imidazol para cada paso. Como producto de la sobreexpresión bacteriana se observó para todas las condiciones ensayadas la formación de cuerpos de inclusión (CI). Estos CI fueron disueltos, aplicando un protocolo de solubilizacion que emplea como agente caotrópico al detergente SDS al 1%.

Conclusión. La adición de imidazol en todos los pasos del proceso solubilizacion-purificación redujo considerablemente la unión de proteínas inespecíficas a la resina de Níquel. Se están realizando ajustes finales, con el fin de obtener la proteína de fusión en su máxima pureza, necesaria para su posterior aplicación y evaluación serológica con sueros humanos y caninos.

Perspectivas futuras. Aplicación de este antígeno en inmunodiagnóstico y la posterior evaluación de nuevos candidatos al diagnóstico diferencial de leishmaniasis humana y canina. Se plantea la evaluación de otros protocolos de disolución empleando agentes caotropicos como Guanidina y Urea que podrían llegar a mejorar la obtención de antígenos solubles.

Horario: 9 hs.

Lugar: Aula B de Anatomía, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional de Salta.

Se ruega puntualidad.

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